寄

语

(资料图片仅供参考)

从2015年开始，我国有几个省、市级水产技术推广站，已经开始做抗微生物药物，对水产养殖动物致病性微生物的药物敏感性检测工作，现在还有一些企业也开始了这项有意义的工作。但是，据我们了解，现在有些人完成的抗微生物药物的药敏试验，仅限于采用纸片稀释法进行的。

其实，采用纸片稀释法测定的致病性微生物对检测药物的感受性结果，只能用于比较致病性微生物对不同抗微生物药物敏感性的差异，或者只能用于给药物定性，而是难以用这个药敏试验检测结果去决定治疗水产养殖动物疾病的用药剂量的。决定某种抗微生物药物在治疗水产养殖动物疾病时的用药量，是需要采用试管浓度稀释法检测的药敏试验结果的。

本文比较详细地介绍了这两种检测方法的药敏试验过程，希望能对正在完成水生动物致病微生物药物敏感性试验的单位和个人有所帮助！

抗微生物药物功效性试验的

重要性与用药量计算方法

摘要：本文介绍了对抗微生物药物进行药敏试验检测的重要意义及其用药剂量计算方法。旨在为科学地使用抗微生物药物、避免和减少致病性微生物对抗微生物药物产生耐药性。文章中对几种检测致病性微生物，对抗微生物药物敏感性的检测方法，进行了重点介绍，指出常用的纸片扩散法（K-B法）只能用于抗微生物药物定性，而仅依靠K-B法获得的抗微生物药物敏感性检测结果，是难以用于实际治疗疾病时用药量计算的。抗微生物药物用药量的计算，需要依靠用试管内系列浓度稀释法，检测抗微生物药物对致病性微生物的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。 关键词：抗微生物药物；功效性试验；最小抑菌浓度；用药量；计算方法 由于致病性微生物对抗微生物药物产生的耐药性（drug resistance），会导致抗微生物药物在防控致病性微生物感染中失去治疗效果，导致各种致病性微生物感染变得越来越难以有效地防控，这将持续威胁着人类有效防控各种致病性微生物感染的能力。时至今日，致病性微生物的耐药问题已经成为导致人类死亡的重要原因，因为耐药致病菌感染而无法治疗的疾病，致死人数已超过艾滋病感染或疟疾等传染性疾病。令人更为担忧的是，多重耐药菌（multi-drug resistant bacteria，MRSA）和泛耐药菌（pan-resistant bacteria）已经在全球范围内快速地传播，导致一些感染已经无法用现有抗微生物药物进行成功地治疗。如果现在不提高对抗微生物药物耐药性问题的认识与重视，在不久的将来，人类将再无抗微生物药物可以使用！ 水产养殖动物由致病性微生物引起的疾病种类较多，每年由于致病性微生物引起的水产养殖动物病害，给我国的水产养殖业造成的直接经济损失至少在百亿元以上。为了控制和减少由致病性微生物引起的严重经济损失，在我国“国标渔药”中，也有较多种类的抗微生物药物。如何科学、规范地使用抗微生物“国标渔药”，对于有效遏制致病性微生物耐药性的产生是非常重要的一个环节。在使用抗微生物药物之前，完成致病性微生物的药物敏感性检测、真正地做到精准用药，就是防控水产养殖致病性微生物耐药性产生的重要措施。本文介绍对抗微生物药物进行药敏试验检测的方法，及其在治疗水产养殖动物疾病时用药剂量计算方法。旨在为水产养殖业者科学地选择和使用抗微生物药物、避免和减少致病性微生物对抗微生物药物产生耐药性，提供科学防控水产养殖动物疾病的参考资料。 01

几种常用的药敏试验检测方法

在致病性微生物离体条件下，完成的抗微生物药物对致病性微生物的药物敏感性试验，简称药敏试验（Antimicrobial Sensitivity Test，AST）。药敏试验是指致病性微生物在离体条件下，测定用药物抑制或杀灭致病性微生物能力的试验。常用的监测方法有纸片扩散法、液体培养基稀释法、琼脂板稀释法、E-test法和自动化仪器法等，本文仅介绍前2种检测方法。 1.1纸片扩散法纸片扩散法药敏试验的原理是，将含有定量的抗微生物药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗微生物药物物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制供试细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对致病性微生物的抑制作用强弱。 该方法是将含有定量抗微生物药物的滤纸片（药敏片），贴在已接种了待测试的致病性微生物的琼脂表面上，药敏片中所含的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗微生物药物的浓度呈对数减少，在纸片的周围形成药物浓度梯度。导致药敏片周围能抑菌的药物浓度范围内的致病性微生物就不能生长，而处于抑菌范围外的致病性微生物则可以生长，因此，在药敏片周围形成透明的抑菌圈。不同抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小即可以反映测试致病性微生物对药物的敏感程度，并与该药物对测试致病性微生物的MIC呈负相关。 1.1.1实验材料1.1.1.1培养基生化试剂商店有售各种培养基。不同种类的致病性微生物的药敏试验可选择不同的培养基，如做嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的药敏试验就可选择（脑心浸液琼脂）BHIA培养基。 1.1.1.2药敏纸片可以购买或者自制。自制药敏纸片时，取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6.0mm直径的圆形纸片。取圆形纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15~20min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使其完全干燥。 接着，向上述含有50片滤纸片的青霉素瓶内加入药液0.25mL，并翻动滤纸片，使各滤纸片充分浸透药液，翻动滤纸片时不能将其捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，待其干燥后即密封，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处保存，制作好的药敏试纸的有效期一般为3~6个月。 需要注意的是药敏纸片的质量一定要标准，这是做好药敏试验的关键。如果药敏纸片质量参差不齐（制作药物纸片时，如果选择的滤纸厚薄不一致，或者有缺损，就会导制备的药敏纸片中药物含量不均匀），常常引起抑制菌环不规则，使药敏结果判断不准确。因此，药敏纸片间差和准确度都一定要达到标准。同时，为了保持药敏纸片中的药物活性，药敏纸片的pH一般要求为中性；同时将其置放低温条件（-10℃）下保存，避免潮湿。盛装药敏纸片的容器自低温处取出时，应防置在室温条件下平衡至少10min后再打开包装容器，避免冷凝水影响到药效 其三，自制药敏纸片还需要自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用纯水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度。按1.0g药物需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制试验药液所加纯水的毫升数。如10.0g药物可配50.0kg饲料，其换算方法为1.0g本品加5000.0mL纯水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。 1.1.1.3待测致病性微生物即为拟测定药物敏感性的致病性微生物。需要注意的是，因为不同的致病性微生物对同种药物的敏感性是不相同的，药敏纸片法测定相同药物对不同种类的致病性微生物的抑菌效果时，可能会观察到直径不同大小的抑菌环。如果致病性微生物不纯，该供试微生物在试验中所产生的抑菌环与纯培养状态下所产生的抑菌环大小差异比较大，就会影响对药敏试验结果判断的准确性，最终导致执业兽医在疾病治疗中难以参考药敏试验结果选择合适的抗微生物药物。 一般而言，应该避免直接挑取初分离的菌落做药敏试验，除非在暴发性疾病流行的紧急情况下、当革兰染色提示出分离微生物为单一种类时，可以直接挑取菌落做药物敏感试验。但是，其结果也仅能作为药敏试验结果的初步报告，随后必须用标准方法重复完成药敏试验。 1.1.1.4仪器高压灭菌锅、超净台、接种环、酒精灯、培养箱、移液器、滴头，等。 1.1.2实验操作1.1.2.1接种在超净工作台上或者无菌室中，用经火焰灭菌（酒精灯）的接种环挑取适量待测致病性微生物，以划线方式将其涂布到已经铺有培养基平皿上。具体操作方式是，用灭菌接种环挑取适量致病性微生物，分别在培养基平皿的边缘相对应的四点涂菌，以每点开始划线涂菌至培养基平皿中的1/2。然后，再找到第二点划线至培养基平皿中的1/2，依次划线，直至将致病性微生物均匀密布于培养基平皿中。（另：也可以挑取待测试的致病性微生物与少量生理盐水中，制成致病性微生物混悬液，用灭菌棉拭子将待检致病性微生物混悬液涂布于平皿培养基表面。要涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀）。 1.1.2.2贴药敏纸片在无菌条件下，将镊子在酒精灯上火焰灭菌后略停，取药敏片贴到培养基平皿表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片所含药物名称要记住。 1.1.2.3培养将接种并且贴上药敏纸片的培养皿置于28℃培养箱中，恒温培养24h后，凭肉眼观察试验效果。 1.1.2.4结果判断与标准在涂有致病性微生物的平皿上，药敏纸片中的抗微生物药物在琼脂内向四周扩散，其药物浓度呈梯度递减。因此，在药敏纸片周围一定距离内的致病性微生物生长受到抑制。在经过一定时间培养后，可形成一个抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之就越小，若无抑菌圈形成，就说明该菌对此供试抗微生物药物具有耐药性。其抑菌圈直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。因此，药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准（表1）。 表1 药物敏感试验结果判定标准

抑菌圈直径（mm）	20以上	15~20	10~14	10以下	0
敏感度	极敏	高敏	中敏	低敏	不敏

注意：（1）具体对于不同的致病性微生物菌株，不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。（2）药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9mm以上为高敏，6~9mm为低敏，无抑菌圈为不敏。 1.1.3影响药敏片试验结果的主要因素1.1.3.1培养基致病性微生物药敏试验所用的培养基种类较多，在一般情况下，采用世界卫生组织（WHO）组织统一要求的M-H培养基，因为这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质。 致病性微生物药敏试验的培养基厚度大约为4.0mm，若培养基厚度大于4.0mm，会使细菌出现耐药；若厚度小于4.0mm，则可能导致本应耐药的容易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca、Mg、A1等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。 1.1.3.2药敏纸片药敏纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏纸片的滤纸一般是使用加厚型的滤纸，因为这种滤纸杂质少，对药物保存无太大影响。如果使用普通滤纸的话，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，所以使用普通滤纸加工的药敏纸片对药物有较大的影响。药敏纸片的pH一般要求为中性，这样才适合药的活度。药敏纸片的厚度要求大约1.0mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6.00~6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。 药敏纸片的片间差和质量好坏是做药敏试验成败的关键。如果是从商店购买的药敏纸片，就可能会有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意药敏纸片的保存，因为有的药敏纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。 1.1.3.3致病性微生物由于各种致病性微生物对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果供试致病性微生物不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此，需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/mL左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，确定菌液浓度。 药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互混淆，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该药对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否，结果不够准确。 1.1.3.4培养时间对于水产动物致病性微生物一般培养温度和时间为28℃条件下培养18~24h为宜，有些抗菌药扩散速度比较慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的培养基平皿，先放置于4℃冰箱内2~4h，使药敏纸片中的抗菌药预扩散，然后再放28℃温箱中培养，这样就可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。 1.2液体培养基稀释法该方法适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型致病性微生物，如肠杆菌科、葡萄球菌属和肠球菌属；嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎链球菌及其他链球菌等菌株，还适用于厌氧菌、酵母样真菌及支原体等。 1.2.1实验材料1.2.1.1培养基根据不同致病性微生物的药敏试验可选择适当的培养基，制作成相应的液体培养基。 1.2.1.2药物与药敏纸片法采用的药物相同，也可以利用原料药物进行。 1.2.1.3致病性微生物与上述药敏纸片法采用的致病性微生物要求相同。 1.2.1.4仪器高压灭菌锅、超净台、接种环、酒精灯、培养箱、移液器、试管、试管架、滴头，等。 1.2.2实验操作1.2.2.1药物的稀释根据每种药物、致病性微生物种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素浓度稀释范围，用阳离子调节的M-H肉汤以2n进行倍比稀释抗微生物药物（如256、128、64、～0.125……）。将稀释后的药物加入试管，或加入冷却至45~55℃M-H琼脂培养基中，立即在无菌条件下制作系列药物浓度梯度的药敏试验试管（图1）。 图1试管内药物敏感试验的试管内药物添加方法 1.2.2.2致病性微生物菌液配制用无菌生理盐水或M-H肉汤配制成0.5麦氏单位浊度的菌悬液。 1.2.2.3接种与培养在配制好的含药浓度梯度液体培养基试管中加入上述供试致病性微生物的菌悬液，使其终浓度为10⁵cfu/mL。制备好的药物敏感测试试管放置于培养温度和时间为28℃条件下，培养24h以上，再观察试验结果。 1.2.2.4结果观察液体培养基稀释法获得的是供试药物对致病性微生物的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）。 MIC的判读即为肉眼观察无致病性微生物生长试管中的最低药物浓度，为该该供试药物的MIC。 MBC的判读即为供试药物杀灭99.9%或以上受试致病性微生物所需的最低浓度。具体做法是将高于MIC 1~3个稀释度的试管中的培养液，转接种于相应的培养基平皿上，在28℃恒温条件下培养18~24h，与无致病性微生物生长的平皿对应的药敏试管中的药物浓度，即判为杀灭99.9%或以上受试菌所需的MBC。 02

抗微生物药物用药量计算方法

2.1环境因素对水产养殖动物药物吸收效率的影响抗微生物药物的用药途径是针对生活在水体中生活的水生动物使用的。因此，水产用兽药对水生动物的作用与治疗疾病的效果，会或多或少地受到水体环境和给药方式等因素的影响。如养殖水体的水温和pH等均会影响到水产用兽药的用药效果。当人们对水产养殖动物口服给药时，还会受到作为水产用兽药载体的鱼用饲料的理化特性等因素的影响。 为了观察饲料颗粒大小、养殖水体pH和水温等因素对饲料中药物溶出速率的影响，Fribourgh等将盐酸土霉素添加在饲料中，使盐酸土霉素在饲料中的含量达到1.83 mg/g，制作成两种不同规格的圆柱形颗粒饲料，分别将其称为A与B型颗粒饲料。将这两种饲料投入到具有不同pH和水温的水体中以后，测定了两种不同规格药物饲料中的盐酸土霉素的溶出速度。 试验方法是分别用纱布将上述两种药物饲料包装后，沉放在1500.0 mL蒸馏水中，在经过3、9、15min，取出饲料包装袋并通过测定蒸馏水中的抗生素含量，推定药物从颗粒饲料中的溶出状况。结果见表2。从表2中所列测定结果可以看出，水体的水温与pH均可以影响A和B型饲料中盐酸土霉素溶出的时间和速度。共同的趋势是，在开始试验后的3min内，药物溶出的速度比较快，随着时间的延长，药物从饲料中溶出的速度逐渐下降。但是，在药物饲料入水后的9~15min之间，药物的溶出量要多于3~9min之间的量。这种现象可能是与颗粒饲料的吸水状态有关的。 表2 盐酸土霉素从不同直径颗粒饲料中的溶出速度比较（Fribourgh等，1969）

药物饲料及测定条件	A型	B型
直径与长度（mm×mm）	3.17×6.35	6.35×12.7
平均颗粒重量（g）	0.08	0.48
表面积（mm2）*	79.2	316.69
容积（mm2）	50.12	402.20
比重	1.60	1.19
表面积/容积比	1.58	0.79
pH 7.0条件下各种温度对药物溶出率的影响	A型	B型
13℃3min	2.01	1.16
9min	4.98	2.58
15min	7.91	4.21
23℃3min	5.27	2.93
9min	10.39	6.31
15min	19.53	11.41
33℃3min	6.27	3.74
9min	11.41	8.43
15min	20.72	14.72
23℃条件下不同pH值对药物溶出率的影响	A型	B型
pH 3.0 3min	6.41	3.08
9min	13.52	7.41
15min	22.31	10.62
pH 7.0 3min	5.27	2.93
9min	10.39	6.31
15min	19.53	11.41
pH 11.0 3min	3.16	1.95
9min	5.51	3.05
15min	9.18	4.96

*因为盐酸土霉素是通过圆柱形颗粒饲料表面溶出的，将圆柱形饲料的半径以“r”代表，长度以“h”代表，表面积/容积比就可以下式计算。 随着水温的上升，饲料中药物的溶出率也随之增加。在pH 7.0、水温23℃的条件下，药物从颗粒饲料中的溶出率差不多是水温13℃条件下的2倍，而在33℃条件下，虽然较23℃条件下的药物溶出量有所增加，但是，差异并未达到2倍的水平。温度越低药物从饲料中的溶出率越低，由于药物向水体中逸散量少，损失也就相对较少。因此，他们认为仅就药物从颗粒饲料中的溶出而受损失程度而言，与高温条件下的用药量相比，低温条件下的用药量可以相对减少一点。 将A与B型饲料进行比较，观察表面积/容积比，B型饲料只有A型饲料的1/2左右，B型饲料的药物溶出率也只有A型饲料的1/2左右。这说明饲料的表面积越小药物的溶出率就越低。颗粒饲料的表面积/容积比的比值越小，药物从中溶出速度越小，与小型颗粒饲料相比，颗粒较大的颗粒饲料对于保持药物饲料投喂到水体中后稳定性是有好处的。不过，随着每次投喂饲料颗粒数量的减少，鱼群均匀摄食就变得更为困难，这一点在利用磺胺类药物饲料完成的试验中已经获得证实。 与其他形状的颗粒饲料相比，球型颗粒饲料的表面积/容积比的比值是最小的。因此，球型颗粒饲料对于保持药物在饲料中的稳定性也是最好的。一旦将同样体积的A型和B型颗粒饲制作成球状后，表面积/容积比的比值分别为1.31和0.66，较圆柱状颗粒饲料的比值更小。 水体pH对颗粒饲料中药物溶出状况影响的观察结果表明，将试验水温设定为23℃，比较pH 3.0（1.0 N-HCl），pH 7.0和pH 11.0（1.0 N-HaOH）条件下颗粒饲料中药物溶出结果时，在3种不同pH条件下，也是B型饲料中药物的溶出率只有A型饲料的1/2左右。当养殖水偏酸性时药物更容易溶出，而在碱性水体中颗粒饲料中的药物溶出速度比较缓慢。一般而言，养鱼池塘的水质不会达到pH 3.0的状态，而大多数池塘养殖水是偏碱性的。所以，偏碱性的养殖池水是有利于投入水体中的药物颗粒饲料的稳定性的。在酸性水体中盐酸土霉素更容易溶出，可能是由于盐化后的土霉素更容易溶于水的缘故。淡水和海水的pH存在差异，饲料被鱼类摄取后进入pH 3.0左右胃及肠道中，饲料中的药物即更容易溶出，这种现象已经被许多试验结果所证实。 为了防止药物从颗粒饲料中大量溶出，对于药物饲料的投喂方式和程序进行了研究。结果证明缩短药物饲料的投喂与被摄食之间的间隔时间，对于防止药物从颗粒饲料中溶出是最重要的。因此，他们认为深入研究药物饲料的对养殖鱼类的有效投喂方法是非常重要的。 2.2对不同水产养殖动物的用药系数日本学者通过上述内容的试验研究，采用日清制药公司生产的水产用医药品，在完成一系列如同上述内容的试验研究后，确定了对日本养殖的几种鱼类的抗微生物药物的用药系数（coefficient of administration）。如对锦鲤使用日清公司的水产用医药品时，要在饲料中添加MIC的8.1倍药物（即用药系数是8.1），才能在患病鱼类摄食药物饲料后，其血液中的药物浓度达到MIC的抑菌浓度。 Fribourgh等根据上述试验结果，即对土霉素等抗生素类药物给予鱼类的方法与用药效果进行了比较详细的研究后，认为对鱼类口服给药时，要达到药物对鱼类疾病良好的治疗效果，还必须要满足如下的一些 基本条件：（1）给予的药物在饲料中能均匀地分布。 （2）在饲料中含有抑制和杀灭致病菌所需要的充分药物剂量，当鱼类正常摄食饲料后能在鱼体内达到治疗疾病所需要的药物浓度。 （3）给予的药物在饲料中的稳定性良好。 （4）制备的药物饲料对鱼类具有良好的适口性。 （5）饲料中的化学成分对药物理化性能不会产生明显的影响。 （6）在药物饲料被鱼类摄食之前，其中含有的药物不会大量地从饲料中溶出。

转载声明

本文版权属于农财宝典（ncbd0000），未经授权，谢绝转载。

作者：华中农业大学 陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军

编辑：郑燕云（微信号zhengyyun11，新闻爆料、转载授权请加微信

热点回顾

扫码进群，了解更多行业资讯

活动信息

一起为“大国渔业”加油！

点亮“在看”↓↓↓